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        重要啤酒成分與氣相色譜分析

         更新時間:2011-06-28 點擊量:6072

              近年氣相色譜法(GC)已成為國內啤酒業的重要儀器分析手段。本文綜述了重要啤酒成分及其GC法分析手段,特別對嚴重影響啤酒質量的重要成分作以介紹,并總結了國內外對其分析測定的GC法。

          國外關于GC用于啤酒研究的zui早報告發表于1956年,20世紀70~80年代,有關GC在啤酒釀造中的應用報告越來越多,分析樣品涉及到大麥、酒花、麥芽、輔料、麥汁、發酵液、啤酒、酵母及污染菌等,分析組分包括醇類、酯類、酮類、醛類、含硫化合物、酸類、后酒花風味、酒花油及非揮發性組分等。而國內啤酒行業應用GC法始于80年代,相關院校及研究所分析工作者做了一些工作,主要分析啤酒中雙乙酰和低沸點的乙醛、醇酯類等輕組分。90年代各大啤酒集團購置GC儀器,對GC法在啤酒釀造過程中有關啤酒研究和質量控制中的應用研究已開展起來,但其深度和廣度遠不及國外同行。本文總結了影響啤酒質量的重要組分及其國內外較完善的GC分析法,以求對國內啤酒行業的GC色譜分析工作者有所裨益。

          GC法作為啤酒研究和質量控制的重要分析手段,首先要考慮樣品的制備?,F有制備方法有四種,包括直接進樣、溶劑萃取、蒸餾和頂空進樣,優缺點見下表。

          方法優缺點

          1.直接進樣簡單、快速易受非揮發性分的干擾;

          2.溶劑萃取具選擇性,可濃縮樣品易造成人為污染,費時;

          3.蒸餾樣品分級不*回收,熱分解,費時;

          4.靜態頂空進樣適于微量組分的檢測樣品取樣量大,受水干擾;

          5.動態頂空進樣可預濃縮微量揮發性組分要求吸咐劑熱穩定性好;

          靜態頂空進樣可直接檢測啤酒中會計師相對高的微量組分,而動態頂空進樣時,樣品由捕集器中吸附劑所吸附而富集,與毛細管柱配合使用,克服靜態頂空進樣的局限性,擴大了檢測組分,提高分離度。Verzele和Sandra建議對低分子量的揮發物采用靜態或動態頂空進樣,中等分子量的揮發物用二硫化碳提取,高等分子量的揮發物用連續的液—液提取。頂空進樣技術,PEG20M和FFAP分析柱,配置氫火焰離子化檢測器(FID)、電子捕獲檢測器(ECD)、火焰光度檢測器(FPD),程序升溫,可分析絕大多數影響啤酒質量的重要組分。

          1、醇類

          醇類是啤酒中重要風味物質,主要有乙醇、醇及芳香醇。乙醇作為酵母的主要終產物,啤酒中含量37000~38000ppm,除氣啤酒可直接進樣,Chromosorb103或GDX—102和103柱,160~190℃恒溫運行,FID檢測,幾分鐘即出乙醇峰,此法可用于常規質控分析和快速在線乙醇監測。

          醇主要包括正丙醇、異丁醇、2—甲基丁醇、異戊醇和苯乙醇。啤酒中醇的標準含量為100~150ppm,醇的測定可由聚乙二醇PEG20M和抗氧化型PEG(FFAP)分析柱,頂空進樣,程序升溫,FID檢測??晒┻x擇的分析柱有ParmaphPEGDB—WaxParmapaispvmsSE—54HP—20MCarbowax20MHP—FFAPHP—5Supelcowax—10AC20等。

          對羥基苯乙醇和色醇(吲哚醇)賦予啤酒溶劑味、不愉快的苦味、酚味,為非揮發芳香醇,由乙酸乙酯萃取,添硅酮玻璃柱10%ul—w—98DiatoportS.程序升溫155~295℃,FID檢測,進行GC定量分析。

          2、酯類

          啤酒中適量的酯類賦予啤酒酯香味,使酒體豐滿協調。如過量超過閾值,形成不愉快的香味。啤酒中酯類總量為15~50ppm。酯類常具有這樣或那樣水果味,增強啤酒風味,其風味指數(濃度與風味閾值比率)越高,啤酒風味組成越有效。一般來講乙酸異戊酯是酯味重要組成部分,其次為乙酸乙酯、已酸乙酯和乙酸苯乙酯。

          酯類由醇類和脂肪酸的乙酰輔酶A衍生物反應在酵母細胞內形成,各種條件下均可,形成的酯類部分透過細胞壁,分泌到發酵液中,部分吸附在酵母細胞內壁,留于細胞內,癸酸旨以上的酯類幾乎全在酵母細胞內,當酵母自溶時,高碳鏈脂肪酸的酯類會釋放出來,作為檢測酵母自溶的重要指標。

          酯類測定常使用DB—Carbowax20MHP—FFAPSE—54DB—5等分析柱,與上述醇測定使用柱子相似,實際分析中低沸點的乙醛、醇和酯類往往一同測定,二氯甲烷、乙酸乙酯和二硫化碳萃取樣品,直接或頂空進樣,程序升溫,FID檢測,進行GC分析。

          3、酮類

          雙乙酰與2.3—戊二酮合稱為連二酮,由于2,3—戊二酮在啤酒中含量較低,一般是0.08ppm,對啤酒風味影響較小。而雙乙酰風味閾值為0.1ppm,啤酒中其含量超過閾值,具有不愉快的奶酪味、餿飯味。一般啤酒雙乙??刂圃?lt;0.1ppm,啤酒<0.05ppm。乳酸桿菌、足球菌等細菌污染亦造成雙乙酰升高,而2,3—戊二酮含量很低,如果二者含量都較高,說明是釀造缺陷造成的。酵母發酵過程中,α—乙酰乳酸經厭氧加熱或α—乙酰乳酸脫羧酶作用,形成乙偶姻。啤酒中含量低至1—5ppm,15—20ppm均為正常值,風味閾值較高50ppm,對啤酒風味影響較小。

          測定聯二酮的方法是:以丙酮、2,3—已二酮或1,2—二氯丙烷作為內標,填充柱10%PEG20M/ChromosorbW(AW—DWS)60—80目或PEG1500/CarbopackC和毛細管柱CarbowaxPorapakQ均可選擇,頂空進樣,ECD檢測,可作為啤酒釀造過程中質量控制分析。

          4、醛類

          啤酒中醛類來自麥汁煮沸中美拉德反應和啤酒發酵過程中醇類還原。大多數不飽和醛類作為啤酒氧化和老化風味,使啤酒產生多種劣味。對啤酒風味和質量有重要影響的醛類主要有乙醛、糠醛和反—2—壬烯醛。

          啤酒中含量zui高的主要醛類是乙醛,丙酮酸脫羧而成,風味閾值10ppm,發酵啤酒中含量3.5~15.5ppm,成熟啤酒中含量應<10ppm,啤酒中含量<6ppm。乙醛影響啤酒口味的成熟,啤酒中含量>10ppm,產生不愉快的粗糙苦味,含量過高,具有辛辣的腐爛青草味。與雙乙酰和硫化氫共同構成嫩啤酒的固有生青味。酵母和麥汁污染雜菌(發酵單胞菌)亦可增加啤酒中乙醛含量。由于乙醛低沸點高揮發性,GC直接進樣就可測出。頂空進樣時,使用PEG或FFAP分析柱,FID檢測,與啤酒中醇和酯類一同測定。

          國外研究表明,糠醛的增加與羰基化合物(主要是醛類)的增加是平行的,因此糠醛水平的變化可指示影響風味的羰基化合物的變化,如糠醛含量>100ppb,可作為原始風味敗壞的指示信號。Davis和Palamand報告其GC定量測定,由于其高沸點低揮發性,利用HPLC方法測定。

          反—2—壬烯醛的形成是啤酒老化的主要原因之一,產生的主要機制是脂類和游離脂肪酸的酶促和非酶促氧化,糖化時發生的不飽和脂肪酸的氧化是zui重要的反應,zui終導致反—2—壬烯醛的形成,風味閾值0.1ppb。測定麥汁過濾后樣品中反—2—壬烯醛方法,麥汁在pH2的條件下回流,用二硫化碳萃取,PEG20M或FFAP柱上分離。B.W.Drose等將樣品經Sep—pakC18濃縮,氮氣吹干,正戊烷洗脫,65℃下florox衍生1小時,CP—Sil19CB分析柱,程序升溫180—300℃,ECD檢測,或啤酒的正戊烷提取液,DBWAX分析反—2—壬烯醛及其前體物,為研究啤酒穩定性提供分析手段。

          5、酸類

          啤酒中的酸類雖不構成啤酒的香味,但是主要呈味物質,啤酒中的酸類及其鹽類控制啤酒的pH值和總酸含量,適宜的pH值和總酸能賦予啤酒柔和清爽的口感,同時作為重要緩沖物質,控制啤酒的pH值,利于各種酶的作用。缺乏酸類,啤酒口感呆滯、粘稠、不爽口;過量的酸類使啤酒口感粗糙、不柔和、不協調,對啤酒香味、起泡特性及酯類形成影響較大。此外酵母和污染菌的脂肪酸分析可作為菌種鑒定指標,啤酒中有機酸種類和含量是判斷啤酒發酵是否正常進行和是否污染產酸菌的標志。

          啤酒中的酸類約100種,分為不揮發酸、低揮發酸和揮發酸。不揮發酸主要有乳酸、琥珀酸、焦谷氨酸、檸檬酸、延胡索酸、丙酮酸、草酸、酒石酸、乙醇酸、異檸檬酸、α-酮式戊二酸等;低揮發酸主要有丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、已酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等脂肪酸;揮發酸主要有甲酸和乙酸。啤酒中主要脂肪為C6-C10。長鏈不飽和脂肪酸主要來自麥汁C16-C18和酵母糖代謝,麥汁中主要脂肪酸是C16-C18,其中C16:1、C18:2、C18:3為重要不飽和脂肪酸,來源于相應的飽和脂肪酸,糖化時在氧的作用下不飽和脂肪酸自氧化和酶促氧化,產生啤酒老化風味物質——不飽和醛類。酵母自溶導致中鏈脂肪酸如丁酸、異戊酸、已酸、辛酸和癸酸含量增加,對啤酒風味影響極大。GC法分析酵母自溶物中脂肪也是十分有意義的。

          David等人將非揮發性酸類甲基化后經氯仿提取,揮發性酸類經乙醚提取,采用玻璃填充柱10%SP10或1%磷酸,100/200目ChromosorbW–AW,115℃恒溫,頂空進樣,FID檢測,定量分析丙酮酸、乳酸、草酸和琥珀酸非揮發性酸類及C2-C7低揮發性酸類。Powell和Vinth等采用二硫化碳萃取直接進樣,FFAP或PEG分析柱,經質譜儀鑒定,分離和測定C2-C12脂肪酸。Susan等將樣品經乙酸乙酯萃取,DB-WAX分析柱,L.E.Stenroos等將樣品經二氯甲烷萃取,Carbowax20M分析柱,程序升溫,頂空進樣,FID檢測,與部分醇、酯、酮類一起測定C2-C10脂肪酸。Karen,Macpherson,Chen和Taylor等用氯仿-甲醇溶液萃取,三氟化硼-甲醇進行甲酯化反應,聚乙二醇或DB-225,10%SPChromasorb柱分離,程序升溫,頂空進樣,FID檢測,測定啤酒、麥汁和酵母中C8-C18游離脂肪酸。

          6、含硫化合物

          啤酒中的含硫化合物分為揮發性和非揮發性,前者占啤酒中含硫化合物的1%,后者則包括無機硫化硫和含硫氨基酸,作為揮發性含硫化合物的前體物質,它們主要來自麥芽、輔料、酒花、釀造水及酵母的硫代謝。啤酒中很多揮發性含硫化合物是強風味低閾值物質,雖然濃度較低,但對啤酒風味的影響很大,特別是一些低分子量的含硫化合物對風味的影響更大,而且這些作用常常對啤酒質量是有害的。對啤酒質量有重要影響的含硫風味物質主要是二甲基硫(DMS)、SO2、H2S和3-甲基-2丁烯-1-硫醇。

          DMS為陳貯啤酒風味的特色組分,標準含量為20~70ppb,過量則有令人不快的腐爛蔬菜/卷心菜味道。麥汁污染細菌直接產生DMS,DMSzui高可達200ppb以上。殺菌和啤酒儲存中,啤酒中DMS含量有微量增加。SO2可與羰基結合形成中性風味組分,延遲啤酒風味的老化和走味,為了改善啤酒的口味穩定性,生產中常常在麥汁制造和濾酒時添加亞硫酸氫鈉、亞硫酸、液態SO2等,添加量不超過20mg/l,在8~10mg/l。SO2含量小于10mg/l,不會引起不愉快的氣味,過量則會產生硫的口味。啤酒中絕大部分H2S由酵母代謝產生,H2S在啤酒中氣味閾值為5~10ug/l。當啤酒中H2S>10ug/l時,啤酒有生酒味;當>50ug/l時,有臭雞蛋味,而啤酒中只有1—5ug/l。啤酒中DMS、SO2、H2S可由CarbopakBHT100柱分離,DMS還可由15%PEG1500ChromasorbW80–100目或FaruphPEG柱分離,頂空進樣,FPD檢測,定量GC分析。

          啤酒曝露于350–500nm光下會產生光解物質3-甲基-2-丁烯-1硫醇(MBT),此物質有硫臭味,風味閾值低于0.1ppb,是由酒花苦味成分異α-酸經光敏感型的核黃素的光解作用產生的。曝露于日光和人工燈光下的啤酒中已檢測出MBT。光照后啤酒樣品頂空吸附于Chromasorb101柱,解吸附后直接進入填充12%DC-200ChromasorbW氟代乙丙烯聚合物FEP,定量GC分析。

          7、酒花油及后酒花風味

          酒花油是啤酒重要的香味來源,來源于酒花及其制品的添加,主要成分為單萜烯和半萜烯、石竹烯、香味烯、律草烯、法呢烯,為碳—氫結構化合物,香氣極不愉快,是生酒花香的來源;碳—氫—氧原子的醇、酮和酯類,如香葉醇和沉香醇具有玫瑰花香、杏木香氣,是啤酒中幽雅香氣的主要成分。酒花品種間酒花油含量和種類是有差異的,以此可作為酒花品種的鑒定。真空蒸餾酒花及其制品的酒花油,要用DB—WAX柱,柱頭進樣,或Parmaphiscms/1701柱,頂空進樣,程序升溫,FID檢測。陳家華等通過循環吸咐法采集酒花香氣成分,乙醚洗脫,OV101毛細管柱,程序升溫,GC/MS定性,共鑒定113種啤酒花香氣成分。

          麥汁煮沸中,單萜烯和半萜烯的碳水化合物一部分隨蒸汽揮發掉,一部分未變化的萜可產生強烈氣味,口味閾值約5ppb、即可感官測出。麥汁中測出的氧化產物如香葉醇、里哪醇、十一醇、α-萜醇及環氧化合物環氧律草烯,將作為微量成分進入啤酒中,zui終啤酒中含有未改變和已轉化好的復雜混合香味組分,稱為后酒花風味。正常啤酒中只要含3ppm酒花油,就可感覺到酒花香氣。Shuso等采用Sep-pakC18柱吸附樣品,二氯甲烷洗脫后濃縮,HP-20M分析柱,FID檢測,定量分析啤酒中里哪醇和環氧律草烯。

          8.非揮發組分

          (1)糖類

          麥汁糖化時,淀粉經酶促反應主要產生可發酵性糖類,包括單糖(果糖和葡萄糖)、雙糖(蔗糖和麥芽糖)和三糖(麥芽三糖)。經酵母發酵代謝,麥汁中絕大部分可發酵性糖類轉化為各級代謝終產物,形成啤酒中各種風味物質。麥汁中可發酵性糖類的合理組成,對研究酵母的降糖性能和形成啤酒特定風味有重要影響。發酵后啤酒中殘留的糖類主要有麥芽糖、麥芽三糖、非發酵性糖以及甘油,它們組成啤酒中的甜味物質和營養物質。

          ASBC建議采用Brobst和LOtt的方法,樣品加到吡啶中,在催化劑三氟乙酸的催化下與六甲基二硅胺反應,產生的糖類異構體,給定性和定量工作增加困難。Jamieson吸取了Brobst的可取之處,采用OV一17SE一30SE一52分析柱,程序升溫,FID檢測,定量分析可發酵糖,但啤酒樣品必須干燥。

          (2)氨基酸

          麥汁糖化時,蛋自質經酶促反應主要產生18種游離氨基酸,經酵母發酵代謝,麥汁中絕大部分游離氨基酸轉化為各級代謝終產物,形成啤酒中各種風味物質。麥汁中氨基酸的合理組成,對形成雙乙酰、含硫化合物、醇和酯類等風味物質有重要影響,發酵后啤酒中殘留的氨基酸可作為啤酒中的營養物質。

          測定游離氨基酸將樣品經離子交換柱去除不相關分子,衍生為具揮發性的三氟代乙基丁酯,串連OV一17/210或ChromasorbW柱,定量分析組氨酸、色氨酸、精氨酸和半胱氨酸,其它氨基酸制成七氟丁酰異戊酯衍生物在SE一30柱上分離。

          (3)酚類

          啤酒中酚類分單體酚和多聚酚,主要來自麥芽和酒花,啤酒中含量25~60ppm和70~100ppm。多酚是啤酒口味助劑,賦予啤酒醇厚性,增強苦味。低分子多酚比高分子多酚沉淀蛋白質的能力要強,高分子多酚的活性較差并保留在麥汁中,使啤酒色澤加深和口味粗糙,低分子多酚具有還原性。使啤酒口感新鮮,對啤酒口味穩定性有促進作用。多酚被氧化,加深啤酒色度,破壞啤酒膠體穩定性,使啤酒苦味變粗糙并產生不愉快的后苦,是啤酒澀味、陳舊味的主要原因之一。酚類與蛋白質形成的復食物,會造成啤酒混濁。包裝后的啤酒在室溫和突然低溫下儲存一定時間,啤酒中的單體酚和多聚酚會與蛋白質結合,產生混濁,混濁產生速率可作為包裝啤酒的貨架壽命指標。

          揮發性酚類可采用蒸汽蒸餾,氧化鋁柱或溶劑萃取濃縮后進樣,氣一液色譜分離測定。非揮發性酚類多采用離子交換樹脂尼龍一66和PVPP等固體吸附劑,甲醇、乙酸乙酯等溶劑革取,在吡啶中與六甲基二硅氯烷(HMDS)及*基氯硅烷或HMDS一二甲基甲酰胺,制成*基硅醚(TMS)衍生物,可選擇sE一30OV一1Dexsil300GCSE一52分析柱,GC一MS聯用鑒定啤酒中70多種酚類。

          釀造水、大麥等原料中的余氯會與麥芽中的多酚形成氯酚臭味,細菌和化學物質污染亦會造成氯,酚臭味,樣品富集后,乙?;磻谷蹼娯撔缘姆宇惢衔镛D化為具有強電負性的酚乙?;苌?,選用OV101SE-300V-10V-17ChromosorbWAWDMCS分析柱,ECD檢測。

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